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| 液相色譜層析分離法 |
| 點(diǎn)擊次數(shù)：2770 更新時(shí)間：2011-09-07 |
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液相色譜層析分離按其固定相的性質(zhì)可分為凝膠色譜、疏水性液相色譜、反相液相色譜、離子交換液相色譜、親和液相色譜以及聚焦液相色譜等類型。用不同類型的液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對(duì)應(yīng)的普通液相層析的原理相似。其不同之處是液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好，且須在色譜儀中進(jìn)行。
液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。
1、進(jìn)樣系統(tǒng) 一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣器完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
2、輸液系統(tǒng) 該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47~4.4×107Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH值，或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。
3、分離系統(tǒng) 該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長(zhǎng)度為10～50cm（需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管），內(nèi)徑為2～5mm，由"不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）。固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹(shù)脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基團(tuán)基本已除去）、多孔性（孔徑可達(dá)1000?）和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過(guò)機(jī)械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基團(tuán)（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等）或配體的有機(jī)化合物。因此，這類固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來(lái)。
另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。 再者，液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C，通過(guò)改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。
4、檢測(cè)系統(tǒng) 液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器三種。 （1）紫外檢測(cè)器 該檢測(cè)器適用于對(duì)紫外光（或可見(jiàn)光）有吸收性能樣品的檢測(cè)。其特點(diǎn)：使用面廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測(cè)下限為10-10?g/ml）；線性范圍寬；對(duì)溫度和流速變化不敏感；可檢測(cè)梯度溶液洗脫的樣品。
（2）示差折光檢測(cè)器 凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。目前，糖類化合物的檢測(cè)大多使用此檢測(cè)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低（檢測(cè)下限為10-7?g/ml），流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測(cè)。
（3）熒光檢測(cè)器 凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測(cè)器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測(cè)定，其靈敏度很高（檢測(cè)下限為10-12～10-14?g/ml），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測(cè)均可采用。
（4）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開(kāi)展。
文章關(guān)鍵詞：液相色譜層析分離 |
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