（一）試劑PCR儀
?。?）引物：決定擴(kuò)增的特異性。根據(jù)檢測(cè)的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生
物都有自己特異的引物。
?。?）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。
?。?）10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl（pH8.4,20℃）150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。
?。?）5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度用UV吸收法測(cè)定。現(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。
（5）DNA模板：用處理液將待測(cè)標(biāo)本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標(biāo)本中被檢測(cè)的DNA。
?。ǘ┎僮鞒绦?a href="http://www.kesheju.cn/whasp-Products-2644629/">PCR儀
過去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR儀必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。具體如下：
?。?）向一微量離心管中依次加入
DNA模板 102-105拷貝
引物 各1μmol/L
dNTP 各200μmol/L
10×PCR緩沖液 1/10體積
ddH2O 補(bǔ)到終體積（終體積50μl-100μl）
混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實(shí)驗(yàn)研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25μl，只要試驗(yàn)人員加入處理好的樣品就可以了。
（2）加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97℃變性10min。
?。?）冷至延伸溫度時(shí)，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合?，F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。
?。?）PCR儀的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。zui后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。
PCR儀尚可用于組織標(biāo)本DNA的擴(kuò)增。由于固定組織標(biāo)本的DNA常發(fā)生降解，就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術(shù)引入固定包埋組織內(nèi)DNA分析。他們先從組織標(biāo)本中提取DNA，再用PCR進(jìn)行特異性的DNA擴(kuò)增，應(yīng)用這種方法，他們成功地從保存30至40年之久的組織標(biāo)本DNA中擴(kuò)增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA，操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對(duì)Impraim的方法進(jìn)行了改進(jìn)。他們將固定包埋的組織塊制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內(nèi)。加入400μl二甲苯脫脂，離心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去殘余二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應(yīng)基質(zhì)，將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法進(jìn)行DNA擴(kuò)增。
在應(yīng)用PCR方法檢測(cè)RNA病毒時(shí)，首先應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進(jìn)行擴(kuò)增，因?yàn)镻CR只能對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，我們把這種RNA的PCR反應(yīng)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，簡(jiǎn)稱RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過程叫做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成。 文章關(guān)鍵詞：PCR儀 |
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