質(zhì)粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項基本實驗技術(shù)，但提取方法有很多種，以下介紹一種zui常用的方法：
堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：
1、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細胞于2ml LB培養(yǎng)基。
2、37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
3、取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。
4、加0.lml溶液I（1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0）充分混合。
5、加入0.2ml溶液 II（0.2 mM/L NaOH，1％ SDS），輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1預(yù)冷溶液III（5 mol/L KAc，pH4.8），輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管
8、加入等體積的異戊醇，混勻后于?0℃靜置10min。
9、再以10，000rpm離心20min，棄上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗滌一次，抽干所有液體。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE緩沖液中
煮沸法
1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ離心30秒。
2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。
3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml）, 渦旋振蕩3秒鐘。
5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。
7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。
8、取20ml進行電泳檢查。
質(zhì)粒DNA的大量提取和純化DNA的提取
在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒DNA。大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。
（一）、堿法
1、取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的含pBS質(zhì)粒的細菌培養(yǎng)液250ml，4℃下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。
2、將細菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預(yù)冷的STE中（此步可省略）。
3、同步驟1方法離心以收集細菌細胞。
4、將細菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細胞。
5、加入12ml新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴10分鐘。
6、加9ml用冰預(yù)冷的溶液III, 搖動離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物,冰上放置15分鐘,此時應(yīng)形成白色絮狀沉淀。
7、4℃下5000g離心15分鐘。
8、取上清液,加入50ml RNA酶A（10mg/ml）, 37℃水浴20分鐘。
9、加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。
10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g離心10分鐘。
11、取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG（分子量6000）, 冰上放置60分鐘。
12、4℃下12000g離心15分鐘, 沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鐘。
13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。 質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定 DNA的提取
瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，應(yīng)選用電泳純的，瓊脂糖此級產(chǎn)品篩除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙錠染色后熒光背景zui小。
（1）瓊脂糖凝膠電泳裝置
由于瓊脂糖凝膠電泳既要求不高，而適應(yīng)性又強，在過去20年里已成功地設(shè)計了形形色色及大大小小的電泳槽。對這些裝置的選擇主要是依據(jù)個人的喜惡。使用zui普遍的裝置是Walter Schaffner發(fā)明的水平板凝膠。
水平板凝膠通常在一塊可安放于電泳槽平臺的玻璃板或塑料盤上灌制。在有些裝置中，則可將凝膠直接鋪在平臺上。凝膠恰好浸在緩沖液液面下進行電泳。凝膠的電阻幾乎與緩沖液的電阻相同，所以有相當(dāng)一部分的電流將通過凝膠的全長。
（2）瓊脂糖凝膠的制備
瓊脂糖凝膠的制備是將瓊脂糖在所需緩沖液中熔化成清澈、透明的溶液。然后將熔化液倒入膠模中，令其固化。凝固后，瓊脂糖形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。通貫?zāi)z的電場接通后，在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移。
（3）瓊脂糖凝膠的染色
電泳完畢，將瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移入含EB的染液中，染色10分鐘，取出紫外燈下觀察 文章關(guān)鍵詞：DNA的提取 |
